Nano bạc điều trị vết thương đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu khác nhau. Tuy nhiên, có một điều các nhà khoa học nhận thấy đó là kích thước của hạt nano bạc có ảnh hưởng tới khả năng làm lành các vết thương rõ rệt. Với các hạt nano bạc có kích thước khác nhau thì khả năng điều trị vết thương rất khác nhau. Bên cạnh đó, chất bảo vệ bề mặt hạt nano cũng đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong khả năng giúp vết thương mau bình phục. Đây cũng là câu trả lời cho câu hỏi tại sao TSN lại có giá trị khác biệt hoàn toàn so với các dạng nano bạc thông thường trên thị trường, nhất là khả năng liền loét, chống viêm.
Mục lục
Tổng quan về nghiên cứu nano bạc điều trị vết thương
Các hạt nano bạc (AgNP) đã được chứng minh là thúc đẩy quá trình lành vết thương và thể hiện tính chất kháng khuẩn chống lại nhiều vi khuẩn. Trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi, chúng tôi đã kiểm tra các TSN cho thấy một hồ sơ độc tính tốt và các đặc tính điều hòa miễn dịch hữu ích cho các ứng dụng tiềm năng trên da liễu.
Phương pháp nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, thử nghiệm trên vết xước, test kháng khuẩn, test trên hạch bạch huyết sửa đổi cũng như mô hình vết thương nẹp chuột đã được sử dụng để tiếp cận khả năng chữa lành vết thương của AgNPs có TA và không có TA.
Kết quả nghiên cứu
Các AgNP-TA so với nhưng không có thể hiện tính kháng khuẩn hiệu quả chống lại Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus và Escherichia coli và kích thích sự di chuyển của keratinocytes trong thử nghiệm invitro. Các thử nghiệm sử dụng mô hình vết thương nẹp chuột cho thấy các AgNP 33 và 46nm có TA đã thúc đẩy quá trình đóng vết thương tốt hơn, biểu mô hóa, tạo mạch và hình thành mô hạt. Ngoài ra, AgNP gợi ra tác động của VEGF-α, các cytokine PDGF-β và TGF-β1 liên quan đến việc chữa lành vết thương hiệu quả hơn so với kiểm soát và điều trị vết thương bằng TA. Tuy nhiên, cả xét nghiệm hạch bạch huyết và mô hình vết thương cho thấy rằng AgNP- TA có kích thước 13nm có thể tạo ra phản ứng viêm mạnh mẽ không chỉ trong quá trình chữa lành vết thương mà cả khi bôi lên vùng da bị tổn thương.
Kết luận
Các AgNP-TA có kích thước 0,26nm thúc đẩy quá trình lành vết thương tốt hơn so với các AgNP trần hoặc thêm chất bảo vệ khác. Những phát hiện này cho thấy các AgNP-TN có kích thước 0,26nm có thể có một ứng dụng đầy hứa hẹn trong quản lý vết thương.
Giới thiệu về nghiên cứu nano bạc điều trị vết thương hở – tầm quan trọng kích thước hạt nano và chất bảo vệ
Quá trình làm lành vết thương ngoài da là một quá trình phức tạp bao gồm 3 giai đoạn kết hợp cả thời gian và không gian: viêm, hình thành mô mới (tạo hạt và tạo mạch) và tái tạo mô. 3 giai đoạn này bao gồm các tương tác giữa các loại tế bào khác nhau, chẳng hạn như bạch cầu, nguyên bào sợi và keratinocytes và được kiểm soát bởi một số yếu tố, bao gồm cytokine, chemokine, các yếu tố tăng trưởng và enzyme. Sau khi cầm máu ban đầu, phản ứng viêm là một phần quan trọng của quá trình chữa lành vết thương bình thường. Nhưng nếu viêm kéo dài sẽ cản trở bước vào giai đoạn tăng sinh và trì hoãn đóng vết thương. Các vết thương mãn tính ngày nay là một gánh nặng lớn về sức khỏe và vẫn là một vấn đề cần giải quyết trên lâm sàng. Do đó, nhiều nghiên cứu đã tập trung vào các nguyên tắc và cơ chế tăng tốc chữa lành vết thương để phát triển các loại thuốc mới và / hoặc băng gạc thúc đẩy quá trình lành vết thương.
Tầm quan trọng của bạc như một chất chống vi trùng đã được biết đến trong nhiều thế kỷ, và việc sử dụng nó gần đây đã tăng lên cùng với sự phát triển của các hạt nano bạc(AgNP) . AgNP có diện tích bề mặt lớn, giúp một lượng lớn các ion bạc được giải phóng và có khả năng xâm nhập vào da, đặc biệt là vùng da bị tổn thương. Có rất nhiều báo cáo chỉ ra rằng AgNP thúc đẩy chữa lành vết thương và thể hiển đặc tính kháng khuẩn chống lại một loạt các vi khuẩn, bao gồm Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli và Staphylococcus aureus. Băng vết thương có chứa AgNP cũng đã được đề xuất để tăng cường chữa lành vết thương bằng cách giảm phản ứng viêm
Tannin là dẫn xuất phenol thực vật được tổng hợp bởi thực vật qua sự trao đổi chất tao ra sản phẩm. Tannic acid (TA, penta-m-digalloyl glucose) là tannin thủy phân đơn giản và chính
Tannin có tính chất làm se da, chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống vi rút và chống viêm. Về mặt cấu trúc, TA có lõi là glocose và các nhóm hydroxyl của glucose được ester hóa với 5 axit digallic.Mặc dù chiết xuất tanin đã được sử dụng để cải thiện quá trình chữa lành vết thương trong nhiều năm, cơ chế hoạt động chính xác của họ đã không đã được làm sáng tỏ hoàn toàn cho đến nay. Người ta tin rằng tannin có thể thúc đẩy quá trình lành vết thương thông qua một số cơ chế: 1) loại sạch các gốc tự do và oxy phản ứng (ROS), 2) thúc đẩy sự co rút vết thương và 3) tăng sự hình thành của các mao mạch và tăng sinh nguyên bào sợi.
Tổng hợp AgNP với chiết xuất thực vật được gọi là tổng hợp màu xanh , được cho là thân thiện với môi trường. TA là một chất khử và ổn định hiệu quả, cho phép chúng ta để thu được AgNP với hình dạng hình cầu đồng nhất với phân phối kích thước hẹp.Hơn nữa, tổng hợp AgNPs với TA ổn định hơn so với các phương pháp khác.Trong các nghiên cứu trước đây, đã chứng minh rằng độc tính AgNP- TA phụ thuộc vào loại tế bào, với bạch cầu đơn nhân nhưng không phải keratinocytes, tạo ra ROS khi tiếp xúc với AgNPs. Ngoài ra, AgNP-TA kích thước 0,30nm cho thấy một hồ sơ độc tính tốt trong ống nghiệm trong các dòng tế bào HaCaT và VK2-E6 / E7keratinocyte ở người.
Trong nghiên cứu này, khả năng chữa lành vết thương của AgNP-TA đã được thử nghiệm. Độc tính tế bào và hoạt tính kháng khuẩn được thử nghiệm invitro cũng như tác dụng chữa lành vết thương trong in vitro và in vivo. Người ta đưa ra giả thuyết rằng sửa đổi TA có thể thúc đẩy quá trình lành vết thương bằng cách tác động đến phản ứng viêm và tác dụng kháng khuẩn Tầm quan trọng của kích thước hạt nano trong vết thương trong quá trình chữa bệnh cũng được trình bày.
Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Nguyên liệu Nano bạc được tổng hợp bằng phương pháp hóa học và loại bỏ tối đa ion Ag+ tự do với độ đồng đều kích thước hạt kiểm soát chặt chẽ. Các phương pháp thử độc tính và thử hoạt tính được tiến hành cẩn thận.
Tổng hợp AgNP (Nano bạc)
AgNP-TA (kích thước của lõi kim loại: 13, 33 và 46nm) và AgNP không có vỏ bảo vệ Tannic (10- 65nm) được tổng hợp thông qua phương pháp khử hóa học trong nước.
Keo AgNP có kích thước 13, 33 và 46nm được tổng hợp với bạc nitrat và hỗn hợp natri citrat và Tannic acid.
Trong nghiên cứu trước đây của chúng tôi, chúng tôi đã chỉ ra vai trò quan trọng của hỗn hợp này trong quá trình tổng hợp monodisperse-AgNP so với tổng hợp được thực hiện với natri citrate hoặc chỉ với TA. Chỉ sử dụng kết hợp citrate và TA đã tạo ra một phức hợp CA TA hoạt động, cho phép kiểm soát các điều kiện phản ứng dẫn đến đồng nhất kích thước và hình dạng của AgNP.
Một chất keo với kích thước hạt (10-65nm) được tổng hợp chỉ với natri citrate và tạo thành AgNP trần (tổng hợp mà không có TA). Chất keo này đã được sử dụng trong các thí nghiệm làm mẫu chứng. Hạt nano được đặc trưng cho hình dạng, kích thước và kích thước phân phối sau mỗi tổng hợp bằng tán xạ ánh sáng động (DLS) và kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), như đã mô tả trước đây. Độ ổn định keo được phân tích với quang phổ tử ngoại (UV-vis) và thông qua đo lường tiềm năng zeta.
Thử độc tính của Nano bạc có Tannic (TSN) và Nano bạc không bảo vệ bằng Tannic
Độc tính của AgNP đã được thử bằng cách sử dụng bộ kit I V-Apoptosis. Annexin V dương tính, propidium iodide (PI) âm tính được ghi là các tế bào apoptotic, trong khi tất cả các tế bào dương tính PI được coi là bị hoại tử. Những thay đổi trong tiềm năng ty thể là được đo trong các tế bào nhuộm màu bằng thuốc nhuộm cation, 5,5 ′, 6,6′- tetrachloro1,1, 3,3′-tetraethyl-benzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) (Sigma-Aldrich), như được mô tả trước đây.
Các tế bào nhuộm màu được phân tích trong FACSCalibur bằng chương trình CellQuest (BD Bioscatics). Xét nghiệm hấp thu màu đỏ trung tính đã được thực hiện như mô tả trước đây18 Khả năng tồn tại của các tế bào được biểu thị bằng phần trăm của kiểm soát.
Thử kháng khuẩn
S. aureus ATCC 25923, P. aeruginosa ATCC 27853 và E. coli ATCC 15597 đã được sử dụng để xác định các hoạt động kháng khuẩn của AgNP.
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) được xác định trong nước dùng Mueller Tiết Hinton (MHB) môi trường sử dụng phương pháp pha loãng nối tiếp. Các ống nghiệm chứa AgNP pha loãng 2 lần ở nồng độ từ 0,78 đến 50 µg / mL được tiêm với huyền phù vi khuẩn để mang lại mật độ thích hợp (105 CFU / mL) và được ủ trong 18-20 h ở 37 ° C.
MIC được định nghĩa là nồng độ thấp nhất của phụ gia bạc mà tại đó không có độ đục thị giác của môi trường tăng trưởng phát triển. Tất cả các phép đo của MIC các giá trị được lặp lại trong ba lần.
Kết quả nghiên cứu
Nghiên cứu về độc tính, kháng khuẩn và khả năng điều trị vết thương hở của nano bạc và nano bạc bọc Tannic (TSN) cho kết quả khác biệt giữa TSN với nano bạc thông thường. Ngoài ra, kích thước hạt cũng thể hiện sự khác biệt về hiệu quả và độ an toàn.
Tác dụng chống khuẩn của nano bạc và TSN
P. aeruginosa và S. aureus là những vi khuẩn phổ biến nhất gây ra nhiễm trùng vết thương.Các tác dụng ức chế AgNP- TA tốt nhất vào kích thước với 13nm Các AgNP hiển thị các giá trị MIC thấp nhất (1,56 µg / mL cho S. aureus, 3.13 µg / mL đối với P. aeruginosa và 0.78 µg / mL cho E.Coli. Các AgNP 33 và 46nm được sửa đổi TA cho thấy các giá trị MIC tương tự (3.13 µg / mL cho S. aureus,12.5 µg / mL đối với P. aeruginosa và 6.25 µg / mL đối với E. coli). Các AgNP không thay đổi cho tác dụng ứ chế thấp nhất với S. aureus, P. aeruginosa và E. Coli (>50 µg/mL).
Độc tính của Nano bạc và TSN
Tác dụng gây độc tế bào của AgNP đối với điện thế ty thể trong các tế bào L929 phụ thuộc vào liều. Bổ sung các AgNP-TA, 13, 33 và 46nm trong nuôi cấy tế bào ở nồng độ 5 µg / mL dẫn đến làm tăng phần trăm tế bào với điện thế ty thể giảm (19,81% ± 0,53%, 29,65% ± 4,87% và 27,82% ± 3,57%, (p # 0,05) . AgNP-TA 13, 33 và 46nm ở 10 µg / mL dẫn đến sự gia tăng hơn nữa trong tỷ lệ giảm điện thế ty thể. (p # 0,05). AgNP trần (10-65nm) không ảnh hưởng độc tính đối với ty thể. Nồng độ hiệu quả 50 (EC50) cho AgNP tươi (10-65 nm)vẫn cao hơn so với giá trị EC50 cho AgNP- TA13, 33 và 46nm cũng như
Vì sự giảm điện thế ty thể thường xảy ra trước khi gây ra apoptosis, sử dụng nhuộm annexin V để xác nhận độc tính của AgNP. Kết quả của thử nghiệm cho thấy chỉ có các AgNP-TA 13nm gây ra apoptosis trong các tế bào L929 ở mức 5 và 10 µg / mL (p # 0,05) trong khi chỉ các AgNP-TA 13 và 33nm tại 10 µg / mL gây ra hoại tử (p # 0,05).
Thử nghiệm nano bạc điều trị vết thương hở invitro
Khảo sát ảnh hưởng của AgNP-TA về sự di chuyển của keratinocytes trong tế bào. Xét nghiệm đầu sử dụng dòng tế bào HaCaT của con người là một phương pháp đặc trưng để đo sự di chuyển keratinocyte trong ống nghiệm.Vùng trầy xước của các tế bào được điều trị bằng tất cả các AgNP tại 5 µg / mL dường như cho thấy có số lượng keratinocytes nhiều hơn hiện diện trong vùng trầy xước khi so sánh với các tế bào mẫu chứng. Tuy nhiên, chỉ các AgNP- TA (TSN) mới cho thấy một sự gia tăng đáng kể trong di chuyển tế bào.
Khả năng chống viêm của TSN
Để khám phá tiềm năng của AgNP-TA đối với phản ứng viêm, chúng tôi đã thực hiện nhuộm màu với kháng thể đơn dòng thụ thể-1 (Gr-1) (m-1), áp dụng các Ag-NP trần và có TA được áp dụng trên phần lưng của tai chuột bị sẹo. Kháng thể này liên kết với Ly6G, hiện diện trên bạch cầu trung tính và Ly6C, được biểu thị trên bạch cầu trung tính và các quần thể bạch cầu đơn nhân (Ly6G + và Ly6C +). Cả hai quần thể tế bào thể hiện phản ứng viêm sớm.
Ở tai điều trị hoặc không điều trị với AgNP, đếu quan sát phản ứng viêm mạnh mẽ của lớp biểu bì dày và viêm thâm nhập các tế bào trong lớp hạ bì. Tuy nhiên, tai được điều trị bằng AgNP-TA 13nm cho thấy đáp ứng viêm mạnh nhất với hoại tử bên trong lớp biểu bì và sự tham gia mạnh mẽ của lớp hạ bì. Tai được điều trị bằng các AgNP- TA 33 và 46nm hay cả AgNP trần 10- 65 ng chỉ cho thấy một phản ứng viêm nhỏ trong lớp biểu bì và không dày lên.
Các diện tích chiếm bởi các tế bào Gr-1 + là lớn nhất trong nhóm được điều trị bằng AgNP-TA 13nm so với các nhóm khác (p = 0,001) .Để đánh giá kích hoạt hệ thống miễn dịch tại chỗ, kích thích các tế bào lympho phân lập từ các hạch bạch huyết auricular với concanavalin A và đo sự tăng sinh tế bào sau 72 giờ. Các tế bào lympho phân lập từ chuột được điều trị với kích thích giải pháp citral cho thấy phản ứng tăng sinh mạnh nhất.
Điều trị bằng AgNP có bọc hoặc không bọc gây ra phản ứng tăng sinh thấp hơn đáng kể so với citral (p # 0,001). Trong tất cả các AgNP-TA, các AgNP 13nm cho thấy sự tăng sinh cao nhất (p # 0,05).
Các AgNP-TA 33 và 46nm khả năng chữa lành vết thương
Đóng vết thương đã được quan sát trong tất cả các nhóm điều trị trong 14 ngày. Tất cả các động vật được thử nghiệm hình thành vảy tại vị trí vết thương, tồn tại trong vài ngày và để lại những tổn thương còn sót lại trên mô da sau khi chúng biến mất. Đóng vết thương đã được quan sát rõ ràng vào ngày thứ 6 trong tất cả các nhóm thử nghiệm, ngoại trừ AgNP-TA 13nm. Các nhóm AgNP- TA 33 và 46nm đã cho thấy sự cải thiện trong việc đóng vết thương ở ngày thứ 6 và 14 cũng như biểu mô hóa tốt hơn ở tất cả các ngày thử nghiệm so với nhóm đối chứng (p # 0,05) Ngược lại, Tannic làm tăng đáng kể độ dày biểu mô chỉ ở ngày thứ 3.
Ở giai đoạn đầu của quá trình làm lành (ngày 3 tới ngày 6), vết thương trong tất cả các nhóm vẫn có sự thâm nhiễm tế bào viêm rõ ràng, hình thành mô hạt và tăng sinh biểu bì. Tuy nhiên, vết thương được điều trị bằng AgNP-TA 13nm cho thấy phản ứng viêm mạnh hơn và kéo dài so với các nhóm khác (Hình 6). Các tế bào viêm trong các nhóm AgNP-TA 33 và biến mất nhanh hơn và sự hình thành các nang lông đã được quan sát. Điều thú vị là tất cả các nhóm AgNP cho thấy tăng số lượng mạch máu ở vết thương.
Sự hình thành mach máu mới được đánh giá bằng cách đếm số lượng trên mỗi mẫu (Hình 7A). Vết thương được điều trị bằng tất cả các AgNP -TA vào ngày thứ 3 sau khi bị thương đều cho thấy số lượng mạch máu tăng lên đáng kể so với đối chứng (p # 0,05) (Hình 7A). Sau này trong quá trình làm lành, tất cả các vết thương được điều trị bằng AgNP đều tăng đáng kể số lượng mạch máu ở ngày thứ 6 (p # 0,05) (Hình 7A). Tuy nhiên, số lượng mạch máu mới vào ngày 14 trong vết thương điều trị bằng TA 33, 46nm AgNP và AgNP trần đã giảm đáng kể so với nhóm chứng (p # 0,05).
Để đánh giá tình trạng viêm trong vết thương, số lượng bạch cầu trung tính và đại thực bào trên mỗi mẫu đã được tính toán (Hình 7B và C). Trong nhóm AgNP-TA 13nm, bạch cầu trung tính và đại thực bào trong mô vết thương đã tăng đáng kể trong toàn bộ thời gian chữa bệnh (p # 0,05) (Hình 7B và C). Trong nhóm AgNP trần, cả số lượng bạch cầu trung tính và đại thực bào đã tăng đáng kể vào ngày thứ 6 và 14 sau khi bị thương (p # 0,05) (Hình 7B và C). Các vết thương được điều trị ác AgNP-TA 33 và 46nm cho thấy số lượng đại thực bào tăng lên vào ngày 14 (p # 0,05) ,trong khi với AgNP 33nm, số lượng bạch cầu trung tính là giảm vào ngày 14. Sự hiện diện của AgNP trong vết thương đã được tìm thấy trong tất cả nhóm thử nghiệm. AgNP được tìm thấy không chỉ ở đáy vết thương vào ngày thứ 3 mà còn trong phản ứng viêm và lưới ngoại bào (Hình 8). Bạch cầu trung tính rõ ràng thực bào AgNP. Điều thú vị là các hạt nano cũng được tìm thấy trong myofibroblasts-chịu trách nhiệm cho sự co rút vết thương (Hình 8). Sau đó trong giai đoạn sửa chữa mô (ngày 14), tìm thấy AgNP trong mô hạt, cả nội bào và ngoại bào. Hạt nano thường được tìm thấy trong các khu vực xung quanh nang lông mới.
AgNP- TA điều chỉnh sự biểu hiện của cytokine trong vết thương
Mức mRNA của TNF-α, TGF-β1, IL-1β, VEGF-α và PDGF-được đo bằng qRT-PCR (Hình 9). Nhìn chung, các biểu hiện mRNA của TNF-α, TGF-β1, VEGF-α và PDGF-đã tăng đáng kể ở tất cả các nhóm AgNP ở ngày thứ 3 của vết thương so với nhóm chứng (p # 0,05) (Hình 9). Vào ngày thứ 6, nồng độ mRNA của PDGF-β là tăng đáng kể trong tất cả các nhóm thử nghiệm so sánh với nhóm kiểm soát. Mức độ mRNA của IL-1β đã tăng đáng kể vào ngày thứ 6 và 14 sau khi điều trị vết thương trong điều trị vết thương với TA, trong khi AgNP 10-65nm không thay đổi đáng kể mRNA của IL-1β tại tất cả các thời điểm được kiểm tra so với nhóm kiểm soát (p # 0,05) (Hình 9). AgNP- TA điều chỉnh IL-1β mRNA vào ngày thứ 3 khỏi bị thương, trong khi các AgNP-TA 13 và 33nm đã điều chỉnh IL-1β mRNA vào ngày thứ 6 (p # 0,05) (Hình 9). Mức mRNA cao nhất của TNF-α đã được quan sát thấy ở ngày thứ 6 và 14 trong các vết thương được điều trị bằng các AgNP-TA 13nm.
Bàn luận
Chữa lành vết thương vẫn là một vấn đề lâm sàng đầy thách thức, đặc biệt là với các vết thương mãn tính hoặc các biến chứng khó lường. Băng vết thương có chứa AgNP có thể bảo vệ hiệu quả chấn thương do nhiễm vi khuẩn và thúc đẩy tái tạo mô trong quá trình chữa lành vết thương.9,10 Các sản phẩm từ thực vật đã được sử dụng để điều trị vết thương trong nhiều thế kỷ do chất chống oxy hóa, chống viêm và kháng khuẩn của chúng. TA đã được chứng minh là làm ổn định collagen và elastin trong lưới ngoại bào bằng cách ức chế MMP collagenase trong khi tăng cường liên kết ngang collagen.24,25 Ngoài ra, TA ức chế S. aureus, P. aeruginosa và E. Coli hình thành màng sinh học trong nhiều mô hình màng sinh học. Nhiễm trùng là một trong những biến chứng nghiêm trọng nhất làm suy yếu quá trình lành vết thương và tái tạo mô, có thể dẫn đến để đáp ứng viêm kéo dài, và do đó nó trì hoãn việc phục hồi vết thương. Ở đây, chúng tôi đã chỉ ra rằng AgNP- TA ức chế sự phát triển của vi khuẩn hiệu quả hơn các AgNP trần hay TA riêng. Ức chế sự phát triển của vi khuẩn phụ thuộc vào kích thước (Bảng 1) với kích thước AgNP nhỏ nhất cho thấy sự kháng khuẩn mạnh nhất đối với E. coli, trong khi kích thước lớn hơn cho thấy hoạt động ức chế tốt hơn đối với S. aureus. Các AgNP nhỏ cho thấy các đặc tính ức chế tốt hơn nhờ tỷ lệ thể tích bề mặt lớn hơn so với các AgNP hình cầu lớn hơn. Các đặc tính chống khuẩn của AgNP được cho là do sự tương tác trực tiếp của các hạt nano với màng vi khuẩn và protein nội bào cũng như sự hiện diện của bạc ion biocidal được giải phóng từ các bề mặt hạt nano để tăng tương tác với vi khuẩn, vì các hạt nano không biến đổi cho thấy giá trị MIC thấp hơn nhiều.
Trước đây báo cáo rằng AgNP-TA cho thấy ít gây độc tế bào cho cả chuột và tế bào keratinocytes ở người trong thử nghiệm in vitro, nhưng độc tính gia tăng đã được tìm thấy trong bạch cầu đơn nhân ở chuột, cho thấy nội địa hóa hiệu quả AgNPs-TA18,19 Ngoài ra, độc tính cũng là phụ thuộc kích thước. AgNP-TA có kích thước <20nm gây độc tế bào và phản ứng viêm nhiều hơn so với AgNP-TA >20 nm.18,19 AgNP- TA cho thấy ít độc tính đối với nguyên bào sợi L929, và điều này phụ thuộc vào nồng độ và có thể được tính bởi nhỏ nội hóa của hạt nano. Các AgNP- TA đã thay đổi chức năng của ty thể trong nguyên bào sợi Murine, nhưng điều này (Hình 3A và Bảng 2). Kết quả tương tự đối với AgNP10-15nm trong nguyên bào sợi của người.
Nguyên bào sợi đóng vai trò quan trọng trong quá trình chữa lành vết thương, bằng cách tổng hợp và tiết ra collagens. Collagens mới được hình thành có thể lấp đầy các khiếm khuyết mô, cung cấp một khung cho sự di chuyển của các tế bào biểu bì và điều chỉnh sự di chuyển và tăng sinh tế bào.34 AgPN đã được chứng minh là làm tăng sự đóng vết thương thông qua việc thúc đẩy sự tăng sinh và di chuyển của các tế bào keratinocytes. , do đó thúc đẩy sự co rút vết thương. Ở đây, hiệu quả điều trị của AgNP-TA trong chữa lành vết thương được đánh giá bằng cách sử dụng xét nghiệm vết xước trong một hệ thống mô hình in vitro và mô hình vết thương ở chuột. Kết quả từ mô hình in vitro cho thấy AgNP-TA làm tăng di chuyển keratinocyte HaCaT ở trên quan sát so với trong nuôi cấy đối chứng, trong khi AgNP làm tăng di cư không đáng kể (Hình 3B). Khi áp dụng các hạt nano trong mô hình vết thương vết mổ chuột, chúng tôi đã quan sát những thay đổi hình thái khác nhau trong giai đoạn viêm và tái biểu mô, tùy thuộc vào kích thước của AgNP- TA. Việc đóng vết thương nhanh hơn, tái biểu mô tăng lên và số lượng nguyên bào sợi tăng lên đã được quan sát thấy ở những con chuột được điều trị bằng AgNPs- TA 33 và 46 nm so với những con chuột đối chứng. Tuy nhiên, AgNP-TA 13 nm cho thấy vết thương chậm lành ngay cả ở giai đoạn tăng sinh và sửa chữa. Không quan sát thấy việc chữa lành vết thương tốt hơn với AgNPs trần. Các tác giả khác cho thấy rằng không chỉ các AgNP trần kích thước 5–15 nm mà còn các AgNP có đường kính ~ 20 nm cũng tăng tốc tái biểu mô, tăng cường sự di chuyển của nguyên bào sợi và giảm sự xâm nhập của bạch cầu trung tính và đại thực bào tại vị trí vết thương trong mô hình động vật gặm nhấm.
Đánh giá mô học cho thấy các AgNP- TA có kích thước 13nm và ở mức độ thấp hơn, AgNp trần duy trì thâm nhiễm bạch cầu trung tính tại vị trí vết thương lên đến 14 ngày. Ngược lại, AgNP-NP 33nm đã làm biến mất bạch cầu trung tính nhanh hơn trong giai đoạn sửa chữa. Trong các mô hình thí nghiệm phổ biến sử dụng chuột khỏe mạnh, đỉnh tích lũy bạch cầu trung tính vào khoảng ngày 1 và trở về mức bình thường sau ngày thứ 5-10 sau khi bị thương ngoài da. Bạch cầu trung tính hoạt động như lớp hàng rào đầu tiên chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn và các mảnh vụn ngoài, sẽ được tiêu diệt bằng thực bào. Tuy nhiên, sự phong phú của bạch cầu trung tính cũng có thể dẫn đến việc giảm mức độ của các yếu tố tăng trưởng và sản xuất các loại oxy gốc triệt tiêu và sự chậm trễ hơn nữa trong việc chữa lành. Điều này thực sự được quan sát ở đây đối với AgNP 13nm -TA. Ngoài ra, việc điều trị bằng các AgNP 13nm -TA trên da tai phân tầng trong xét nghiệm LLNA cũng dẫn đến kích ứng và viêm cục bộ, thể hiện bởi sự hiện diện của các tế bào dương tính Gr-1, đại diện cho bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân viêm. Điều này cho thấy kích thước hạt nano có thể ảnh hưởng mạnh đến tiềm năng chống viêm của nó. AgNP 13nm-TA độc hơn đối với bạch cầu đơn nhân chuột so với AgNP-TA có kích thước cao hơn. Do đó, có thể kết luận rằng phản ứng viêm tăng lên khi quan sát thấy trong các vết thương tiếp xúc với AgNP 13nm- TA có thể kết quả từ phản ứng độc hại gây ra trong bạch cầu trung tính thực bào và bạch cầu đơn nhân viêm. Các tế bào đơn nhân / đại thực bào của giai đoạn viêm xuất hiện để điều phối quá trình chuyển sang giai đoạn tăng sinh của sự chữa lành. Sự suy giảm của các tế bào đơn nhân / đại thực bào trong giai đoạn viêm làm giảm sự hình thành mô hạt và tăng sinh tế bào ở vết thương trên da chuột. tích lũy đại thực bào ở giai đoạn cuối của quá trình lành vết thương. Đáng chú ý là cả AgNP 33 và 46nm -TA đều duy trì số lượng đại thực bào cao trong quá trình chữa lành. Sự tích tụ đại thực bào này có thể là kết quả của sự hiện diện của các hạt nano rất lâu sau khi bị thương, vì đã tìm thấy AgNP cũng trong lớp hạ bì, chủ yếu là ngoại bào .Vùng da được chữa lành vào ngày thứ 7 cho thấy một số lượng lớn các chất kết tụ của các hạt nano ở phần trên của lớp hạ bì và những chất kết tụ này đã được phát hiện ngay cả sau 17 ngày. Do đó, AgNP có thể ảnh hưởng đến vết thương ở các giai đoạn sau – như tu sửa do có mặt liên tục của nó trong vết thương.
Tất cả các giai đoạn của quá trình chữa lành vết thương được kiểm soát bởi các yếu tố tăng trưởng, chemokine và cytokine khác nhau. Các cytokine tiền viêm được tạo ra bởi các đại thực bào như TNF-a và IL-1β có thể chống lại sự xâm nhập tiềm tàng của các vi sinh vật khác nhau và giúp thúc đẩy phản ứng tăng sinh.42,43 Tuy nhiên, phản ứng viêm dai dẳng sau khi bị thương làm chậm quá trình lành vết thương và làm tăng biến chứng. Trong nghiên cứu này, các AgNP- TA đã cho thấy một chứng cứ thuận lợi về sản xuất IL-1β và TNF-α khi so sánh với các AgNP trần. AgNP-TA và nhóm .Cả IL-1β và TNF-α đều được điều hóa lên sau khi bị thương (cho đến ngày thứ 3, ngoại trừ AgNP- TA 13nm) và giảm vào thời gian sau đó. Các báo cáo trước đây cho thấy rằng AgNP có khả năng ức chế phản ứng viêm để thúc đẩy quá trình lành vết thương. Trước đây, chúng tôi cũng đã chỉ AgPN-TA chứ không phải AgNP trần trong phản ứng viêm điều hòa ở keratinocytes ở người bị TNF-a và LPS.19 Ngoài việc tạo ra một môi trường vi mô gây viêm, đại thực bào còn giải phóng các yếu tố tăng trưởng bao gồm VEGF-α, TGF-1β và PDGF-, thúc đẩy di chuyển keratinocyte và nguyên bào sợi, tăng sinh và hình thành mạch.
Ở đây, chúng tôi thấy rằng AgNP- TA và AgNP trần đều gây ra biểu hiện của VEGF-α, TGF-1β và PDGF sớm trong quá trình chữa lành vết thương (giai đoạn tăng sinh), nhưng hiệu ứng này có thể được chỉ cho AgNP thay AgNP-TA và không phụ thuộc vào kích thước AgNPs. Các tác giả khác cũng chỉ ra rằng AgNP hoạt động hiệu quả trong giai đoạn đầu của quá trình lành vết thương bằng cách điều chỉnh tăng mức độ biểu hiện của các cytokine liên quan đến đường dẫn tín hiệu TGF-1β / Smad, như TGFβ1,45,46 TGFβ1 đóng vai trò quan trọng trong hầu hết tất cả các giai đoạn chữa lành vết thương và hình thành sẹo.46 Gurunathan et al47 đã chứng minh rằng AgNP ức chế sự tăng sinh tế bào do VEGF gây ra, di cư và hình thành ống giống như mao mạch của nội mô võng mạc tế bào cũng như ức chế hiệu quả sự hình thành máu mới gây ra bởi VEGF. Ở đây, chúng tôi đã quan sát thấy một tác động ngược lại, với cả AgNP- TA và AgNP trần gây ra sự điều hòa VEGF sớm trong quá trình lành vết thương. Mặc dù thực tế là tất cả các kích thước của AgNP-TA gây ra sự điều hòa lên của các cytokine liên quan đến chữa lành vết thương, AgNP -TA nhỏ có thể tạo ra phản ứng viêm mạnh mẽ không chỉ trong quá trình chữa lành vết thương mà còn khi áp dụng cho da bị phân chia.
Phần kết luận
Có tính đến không chỉ khả năng thâm nhập của AgNP da và tương tác với hệ thống miễn dịch da mà còn tác dụng điều hòa miễn dịch của TA, chúng ta có thể hi vọng rằng tổng hợp AgNP với TA cho phép chuẩn bị một cái mới loại vật liệu nano. AgNP-TA có kích thước 0,26nm không chỉ cho thấy khả năng tương thích sinh học tốt, kháng khuẩn hiệu quả và đặc tính chống viêm mà còn có thể làm tăng hiệu quả chữa lành vết thương. Do đó, AgNP-NP có thể được sử dụng như một cách băng vết thương lý tưởng cho vết thương ở da.
